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La cloroquina activa la vía de p53 e induce la apoptosis en células de glioma humano Neurooncología El Grupo de Investigación Traslacional, Departamento de Neurocirugía, Universidad Georg-August Gotinga, Robert-Koch-Strasse 40, 37075 Göttingen, Alemania. Neuro-Oncología (factor de impacto: 5,56). 04/2010 12 (4): 389-400. DOI: 10.1093 / neuonc / nop046 El glioblastoma es el tumor cerebral maligno más común en los adultos. Los tratamientos disponibles en la actualidad sólo ofrecen una ventaja de supervivencia paliativos y la necesidad de tratamientos eficaces sigue siendo una prioridad urgente. La activación de la vía de la supresión del crecimiento de p53 / apoptosis es una de las estrategias prometedoras en la orientación de las células de glioma. Se demuestra que la cloroquina derivado de quinolina activa la vía de p53 y suprime el crecimiento de células de glioma in vitro e in vivo en un (U87MG) glioblastoma humano modelo de ratón ortotópico. La inducción de la apoptosis es uno de los mecanismos subyacentes a los efectos de la cloroquina sobre la supresión del crecimiento de células de glioma y la viabilidad. siRNA mediada por la regulación negativa de p53 de tipo salvaje, pero no en las células de glioblastoma p53 mutante afectado sustancialmente la apoptosis inducida por cloroquina. Además de sus efectos de p53 de activación, la cloroquina también puede inhibir el crecimiento de células de glioma a través de mecanismos independiente de p53. Nuestros resultados clarifican la base mecánica subyacente el efecto antineoplásico de la cloroquina y revelan su potencial terapéutico como un complemento a la quimioterapia glioma. Las cifras en esta publicación del artículo: La cloroquina activa la vía de p53 e induce la apoptosis en células de glioma humano cloroquina activa la vía de p53 e induce la apoptosis en células de glioma humano Ella L. Kim, Robin Wu Stenberg, Anne Ru BSAM, Christoph Schmitz-Salue, Gabriele Warnecke , Eva-Maria Bu cker, Nadine Pettkus, Daniel Speidel, Veit Rohde, Walter Schulz-Schaeffer, Wolfgang Deppert, y Alf Giese La traslacional Neurooncología Grupo de Investigación, Departamento de Neurocirugía, Universidad Georg-August Ir ttingen, Ir Göttingen, Alemania (ELKARCS - SE-MBNPVRAG) Universidad de la Escuela de Medicina de Schleswig-Holstein, Campus Lu Beck, Lu beck, Alemania (RW) Heinrich-Pette-Institute, Hamburgo, Alemania Unidad (GWWD) Transformación celular Childrens Medical Research Institute, Westmead, Nueva Gales del Sur , Australia (DS) del Departamento de Neuropatología, Universidad Georg-August Ir ttingen, Ir Göttingen, Alemania (WS-S.) el glioblastoma es el tumor cerebral maligno más común en los adultos. Los tratamientos disponibles en la actualidad sólo ofrecen una ventaja de supervivencia paliativos y la necesidad de tratamientos eficaces sigue siendo una prioridad urgente. La activación de la vía de la supresión del crecimiento de p53 / apoptosis es una de las estrategias prometedoras en la orientación de las células de glioma. Se demuestra que la cloroquina derivado de quinolina activa la vía de p53 y suprime el crecimiento de células de glioma in vitro e in vivo en un (U87MG) glioblastoma humano modelo de ratón ortotópico. La inducción de la apoptosis es uno de los mecanismos subyacentes a los efectos de la cloroquina sobre la supresión del crecimiento de células de glioma y la viabilidad. siRNA mediada por la regulación negativa de p53 de tipo salvaje, pero no en las células de glioblastoma p53 mutante afectado sustancialmente la apoptosis inducida por cloroquina. Además de sus efectos de p53 de activación, la cloroquina también puede inhibir el crecimiento de células de glioma a través de mecanismos independiente de p53. Nuestros resultados clarifican la base mecánica subyacente el efecto antineoplásico de la cloroquina y revelan su potencial terapéutico como un complemento a la quimioterapia glioma. Palabras clave: la apoptosis, la cloroquina, glioma, p53, transcripción G glioblastomas después de la resección quirúrgica y por la radiación y la quimioterapia adyuvante es inevitable, con un resultado invariablemente letal. Los tratamientos disponibles en la actualidad sólo ofrecen una ventaja de supervivencia paliativos, lo que subraya la necesidad de tratamientos eficaces de ser un priority.1,2 urgente Orientación vías de señalización intracelular implicadas en la regulación del crecimiento y la viabilidad de las células de glioma es la base molecular de varios experimental terapéutico strategies.35In la última década, la activación de la vía inhibidora del crecimiento endógeno p53 o restauración de las funciones de p53 en células de glioma mediante la introducción exógena de p53 de tipo salvaje (wtp53) ha sido una estrategia intensamente explorado para suprimir glioma progression.610The tumor supresión p53 sor puede inhibir potentemente el crecimiento celular mediante la inducción de un bloque transitoria o permanente de la proliferación o por dades programas de muerte celular cual ha creado en respuesta a diferentes tipos de estrés celular, que ha proporcionado una justificación para therapies.1113Further contra el cáncer basadas en p53, la relevancia de las terapias basadas en p53 para el tratamiento de glioma se destaca por el hecho de que p53in contraste con la mayoría de otros tumorsis sólido con poca frecuencia mutado en primaria o de novo glioblastomas (menos de 30 mutaciones en el gen TP53, 14El más frecuente forma de este tumor ) .15A ensayo de fase I, siempre y convincente evidencia de que se restablezcan las funciones wtp53 por introducción de wtp53 exógeno es un approach.7,10 factible Sin embargo, la expresión de wtp53 recombinante en células de glioma activa con eficacia el ciclo celular dependiente de p53 puestos de control, pero no induce la apoptosis, 10which lioblastoma es el tumor cerebral maligno más común en los adultos. Debido a su notoria por radiación y la quimio-resistencia, recurrencia del autor (s) de 2010. Publicado por Oxford University Press en nombre de la Sociedad de Neuro-Oncología. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento No comercial (http://creativecommons. org/licenses/by-nc/2.5/uk/) que permite sin restricciones el uso no comercial, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citados. En correspondencia Autor: Alf Giese, MD, La Neurooncología Grupo de Investigación Traslacional, Departamento de Neurocirugía, Universidad Georg - agosto Ir ttingen, Robert-Koch-Strasse 40, 37075 Ir Göttingen, Alemania (alf. giesemed. uni-goettingen. de). Ella Kim, PhD, Neurooncología El Grupo de Investigación Traslacional, Departamento de Neurocirugía, Georg-AugustUniversity Ir ttingen, Robert-Koch-Strasse 40, 37075 Ir Göttingen, Alemania (ella. kimmed. uni-goettingen. de). Recibido el 21 de octubre de 2008 Aceptado el 22 de junio de 2009. Neuro-Oncología 12 (4): 389400, 2010. doi: 10.1093 / neuonc / nop046 la publicación anticipada de acceso 27 de de enero de, 2010 neurooncología desde un punto de vista terapéutico sería la más deseada enfoque alternativo outcome.16An para activar la respuesta de apoptosis dependiente de p53 se basa en la capacidad de algunos agentes para activar la vía de p53 endógeno, ya sea por agentes que dañan el ADN o por los agentes que pueden estabilizar la proteína p53 en la ausencia de daños en el ADN. 17En este contexto, los posibles efectos antitumorales de quinolinas han atraído recientemente agente membrana penetrable interest.1820 cloroquina considerable capaz de intercalarse en el ADN de doble cadena sin causar daño físico a la DNA.21Owing a sus propiedades de base débil, la cloroquina también se acumula en los lisosomas y puede desencadenar la apoptosis a través de la inhibición de la autofagia proteína degradation.2226Widely conocido como larial antima - y drogas antirheumatoid, la cloroquina ha surgido recientemente como un agente anticancerígeno potencial. Los efectos citotóxicos de la cloroquina se han demostrado para las células tumorales derivadas de diferentes tipos de efectos cancers.22,23,27,28The humanos de cloroquina en las células de glioma no se han investigado sistemáticamente pre viamente, pero hay evidencia empírica de que la cloroquina puede suprimir glioma progresión clínica por desconocido mechanisms.29,30Prompted por estos hallazgos, se han examinado los efectos de la cloroquina sobre el crecimiento y la viabilidad de las células de glioma in vitro e in vivo. En este estudio, hemos demostrado que la cloroquina induce sis apopto - en las células de glioma in vitro y suprime el crecimiento de gliomas experimentales in vivo. Nuestros resultados demuestran que el tratamiento con cloroquina en un ación estabilizadora sostenida de la proteína p53 e induce la actividad transcripcional de p53 en células de glioma. Además, se muestra que la cloroquina muestra actividad citotóxica independiente de la activación de la vía de p53 en las células con función de p53 deficiente, aunque en comparación con menos eficiencia con células de glioma con wtp53 funcional. Materiales ISAN aminoquinolinic y Células Métodos y anticuerpos Las líneas celulares de glioma humano utilizados en el estudio se han caracterizado previamente con respecto a sus status.31Cells funcionales de p53 se propagaron en medio esencial mínimo (Biochem) suplementado con suero de ternera fetal 10. Una solución concentrada cloroquina se preparó para cada experimento mediante la disolución de la sal de sodio de la cloroquina en PBS, filtrar a esterilizar, y se diluyó a la concentración deseada en medio de cultivo celular. Las células se recogieron en los puntos de tiempo indicados después del tratamiento cloroquina, se lavaron en PBS enfriado con hielo, y se lisaron en tampón de lisis celular SDS (50 mmol / L Tris HCl, pH 8,0, 150 mmol / L de NaCl, y 1 SDS) que contiene proteasa inhibidores (Roche). p53 humano fue detectado por el anticuerpo DO-7 (BD Pharmingen) o la proteína p53 phosphorylation - 16G8 anticuerpo sensible reconocer fosforilado en Ser15 (Cell Signaling Technology, Inc.). Otros anticuerpos utilizados en el estudio incluyen aquellos contra p21, MDM2, TBP (Santa Cruz Biotechnology), PIG3 (Calbiochem), a-tubulina (Oncogene), bax (Upstate), o exfoliados caspasa-3 (Cell Signaling Technology, Inc.) . Para los análisis de Westernblot, que contiene SDS buffer de lisis celular suplementado con inhibidores de la proteasa. La concentración de proteína se determinó usando el reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich) y la igualada mediante el uso de tampón de lisis SDS. cellswere lisaron en evaluación del crecimiento celular, la muerte celular y la apoptosis Para evaluar los efectos de la cloroquina sobre el crecimiento celular, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2,5. 103cells / pocillo 1 día antes del tratamiento. Después de 24 horas de incubación, el tratamiento con cloroquina se inició por adición de cloroquina a la concentración deseada para el medio. Después de 24 horas de cloroquina incubationwith, las células se lavaron con PBS estéril y se rellenaron con medio fresco. Las células en 6 pocillos replicados se fijaron con glutaraldehído al 3 intervalos de 24 horas. Después de 8 días consecutivos, las células fijadas se tiñeron con el colorante cristal violeta de ADN, se lavaron con PBS, y el colorante se solubilizó en tampón que contiene SDS 1. Se midió la absorbancia a 560 nm y se representó frente al tiempo de incubación. Para evaluar la muerte celular, el porcentaje de células no viables se determinó por el ensayo de exclusión de azul de tripano. Para estimar las tasas de apoptosis, el porcentaje de células apoptóticas se determinó contando el número de células inmunoteñidas positivos para la caspasa-3 activada. la fragmentación del ADN de apoptosis se evaluó mediante la detección de inmunofluorescencia de etiquetado dUTP nick de fin de TDT mediada (TUNEL) - positivecells fragmentación Kit de ensayo, Clontech, Takara Bio). Para evaluar los efectos de la cloroquina sobre la integridad de la función de la membrana mitocondrial, las células no tratadas o tratadas a la cloroquina se tiñeron con el colorante catiónico fluorescente (tetraethylbenzimidazolcarbocyanine 5,50,6,60-tetracloro-1,10,3,30- membrana mitocondrial Kit de detección de potencial, Stratagene), que forma agregados fluorescentes rojas en la mitocondria de las células sanas, pero no en la apoptosis cells.32Red (excitación 550 nm, emisión 600 nm) y verde (excitación 485 nm, emisión 535 nm) de fluorescencia se measuredusinga ( TECAN) para determinar los coeficientes de fluorescencia rojo / verde. (ApoAlertTM ADN iodideJC-1 Spectrafluorplatereader siRNATransfections y la tinción de inmunofluorescencia Las células fueron sembradas en cubreobjetos en placas de 24 pocillos cuture tejidos a una densidad de 0.61.0. 105cells / ml durante al menos 24 horas antes de la transfección. Las células fueron transfectadas withcommerciallyvalidated Validado la cautela , Invitrogen) o inespecíficos siRNA revueltos (control negativo de la cautela, Invitrogen) usando el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones de los proveedores. Por inmunofluorescencia tinción cencia, las células se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4 una en PBS, y se permeabilizaron en acetona / metanol frío (1: 1) mezcla durante la noche. El paraformaldehído-fijos y se lavaron las células permeabilizadas en 0,5 BSA en PBS, se bloquearon en la misma p53-siRNA (TP53 Kim et al. Cloroquina activa de respuesta a p53 e induce la apoptosis en células de glioma 390 neurooncología ABRIL 2 0 1 0 tampón, y se incubó con la caspasa-3 de anticuerpos anticleaved a 48C durante la noche. Las células lavadas se incubaron con Alexa Fluor 555 conjugado anticuerpo de cabra anticonejo (Molecular Probes Inc.) durante 30 min a temperatura ambiente seguido de tres lavados con PBS. Finalmente, las células se lavaron se contratiñeron con DAPI. ortotópico Glioma del modelo y de tratamiento con cloroquina Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la realización tal institutionalguidelinesforanimalwelfareandexperimen-. Para la implantación intracraneal, se recogieron las células U87MG de cultivo en monocapa, se lavaron dos veces, y se resuspendieron en PBS a una concentración de 0.5. 105 / mL. Antes de la implantación, los ratones nude (NMRI, Taconic Europa) se anestesiaron mediante una inyección peritoneal de una mezcla de ketamina / xilazina mezcla de 16 mg de xilazina en 10 ml de PBS) a 0,1 ml / 10 g de peso corporal. Para la implantación, el cráneo fue fijada en un marco estereotáxico (TSE Systems). Las células se inyectan en el caudato-putamen del hemisferio derecho del cerebro utilizando las siguientes coordenadas estereotácticas en referencia a la bregma: 1 mm (eje anteroposterior), 3 mm (eje omedial lateralmente), y 2,5 mm (eje vertical). Un umbral de dosis de cloroquina con respecto a la toxicidad aguda del cerebro se estableció mediante la inyección de 5 ml de 0,7, 7,0, 30, ó 70 mM de cloroquina soluciones en la cápsula interna del hemisferio derecho del cerebro de los ratones anestesiados con ketamina. A 70 mM, se encontró que las inyecciones repetitivas de cloroquina por ser tóxicos, ya que provocaron convulsiones en dos outofthreemice. At30 mM, repetitiveinjectionsofchlor - oquina fueron bien tolerados por todos los animales receptores y no causaron síntomas neurológicos. Por lo tanto, se utilizó una concentración de 30 mM de cloroquina para el tratamiento de xenoinjertos de glioma intracraneal. Al día 10 tación postimplan-, 5 ml de PBS o cloroquina se administró en el sitio utilizado para la inyección de las células tumorales por medio de un tornillo de inyección-bold guiada como described33for 17 días. Veintiséis días postimplante, los animales fueron sacrificados después de una inyección intraperitoneal letal de una mezcla de ketamina / xilazina (50 mg de xilazina y 350 mg de ketamina por peso corporal 1 kg). Los cerebros portadores de tumores se explantaron, se fijaron en formalina al 4, cortado en coronalsections, andembeddedinparaffin. One-tothree - micrómetro de espesor secciones se colocaron en portaobjetos de vidrio y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las áreas más grandes tumorales se determinaron por examen microscópico de secciones histológicas consecutivos y se miden mediante el uso de software Cell-A-imagen (Olympus Soft Imaging Systems). secciones incluidas en parafina se anotaron para la apoptosis mediante el ensayo de TUNEL y la mitosis. Para el cálculo de la apoptosis, así como los índices mitóticos, hasta tres secciones de todo el tumor se puntuaron mediante el cribado del tumor en campos de alta potencia adyacentes. El número de apoptoses o campos mitosescountedwasdividedbythenumberofhigh potencia (hasta 49) utilizada como prueba de tumor. (120 mg ketamineand estadísticos Los análisis Cada punto experimental se ha realizado por triplicado por experimento a menos que se indique lo contrario los datos mostrados representan las medias (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Resultados La cloroquina inhibe celulares de glioma crecimiento Para evaluar el efecto de la cloroquina sobre el crecimiento de células de glioma, el crecimiento de un panel de líneas celulares de glioma con diferente estado de p53 funcional se analizó en presencia de concentraciones crecientes de líneas celulares de la cloroquina. glioma U87MG y G120 expresan wtp53. G130 y líneas G44 expresan no o una p53 truncada debido a aberraciones brutos cromosómicas (G130) o una mutación sin sentido en el gen TP53, 31respectively. G112 y U251 albergan una mutación TP53 dentro de la codon273 de punto caliente y expresan p53 transcripcionalmente mutante. los resultados mostraron que cloroquina fuertemente reprimido el crecimiento de células de glioma de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1A). Aunque se observó el efecto de crecimiento - cloroquina supresión en todas las líneas celulares ensayadas, las líneas celulares con wtp53 (U87MG y G120) aparecieron más sensibles a todas las dosis de cloroquina probó en comparación con líneas celulares que son nulos para p53 (G130), expresa p53 truncada (G44), o al puerto inactivación de las mutaciones de TP53 (U251 y G112). Para examinar si la inhibición del crecimiento por la cloroquina fue una consecuencia de la viabilidad celular afectada, se analizó el porcentaje de células viables en los cultivos no tratados o tratados con cloroquina utilizando un ensayo de exclusión de azul de tripano. Los resultados resumidos en la Fig. 1B muestran que la cloroquina afecta a la viabilidad celular de glioma de una manera dependiente de la dosis. Dentro de la gama de las dosis de tratamiento oquina clorpirifos probados, la viabilidad celular fue haciendo disminuir significativamente las líneas celulares que expresan mutp53 celllineswith, consistente con la noción de que el estado de p53 puede ser un factor importante deter - minar la sensibilidad de las células de glioma a la cloroquina. wtp53 inactivos en comparación con apoptosis contribuye a la muerte cloroquina inducida en células de glioma La cloroquina puede inducir la muerte celular por distintos meca - lisosomal isms. Acaspase independiente de la orientación que se ha descrito para algunos tipos de nontumorigeniccells.26,34 apoptosishas dependientes cloroquina inducida de células deathin differenttypesofmalig - cells22,35and tumor nant en algunos tipos de neurons.25To analizar los mecanismos de muerte cloroquina inducida en células de glioma, se evaluó características de la cascada de la apoptosis, incluyendo la activación de la caspasa-3 y la fragmentación de ADN genómico. células de glioma se trataron con cloroquina en una dosis de 30 mg / ml, una concentración que se encuentra dentro de la ventana de la cloroquina concentraciones (2,040 mg / ml) encontrado para ser citotóxico para todas las líneas celulares de glioma ensayadas (Fig. 1) y que era suficiente para inducir apoptosis en otras células tumorales types.22,23,27 mechanisminvolving inmunofluorescencia en contraste, caspasa beenimplicated en stainingforthe Kim et al. La cloroquina se activa la respuesta de p53 e induce la apoptosis en células de glioma neurooncología A B R I L 2 0 1 0 391 forma escindida de la caspasa-3 reveló que la cloroquina tratamiento ledtotheactivationofcaspase-3, whichisindicative de la inducción de la apoptosis (Fig. 2AC). En particular, las células tratadas con cloroquina en general, mostraron un cambio característico en la morfología nuclear (véase el recuadro, Fig. 2A), que, sin embargo, no coincide con la caspasa-3 activa - ción. la activación inducida por cloroquina de la caspasa-3 se produjo de una manera dependiente del tiempo y se observó primero después de 48 horas de tratamiento con cloroquina (Fig. 2A, se muestra por la línea de U87MG). Después de 96 horas de tratamiento, la mayoría de las células fueron positivas para exfoliados caspasa-3 (Fig. 2B) que indica una respuesta apoptótica robusto. La evaluación de la activación de caspasa-3 por la cloroquina en diferentes líneas celulares se resume en la Fig. 2C. La activación de la caspasa-3 fue considerablemente más profunda en las células de glioma con wtp53 en comparación withthosewithmutantp53 (Fig.2C), lo que sugiere bución acontri - de actividades wtp53 a tosis apop - cloroquina inducida. apoyar aún más el impacto de la apoptosis en la citotoxicidad mediada por la cloroquina, células de glioma tratados Fig. 1. La cloroquina inhibe el crecimiento celular y la viabilidad glioma en cultivo. (A) Evaluación de las tasas de crecimiento celular en células de glioma con el estado funcional conocida de p53.31Cells fueron tratados con un intervalo de concentraciones de cloroquina indicadas en las leyendas. (B) Valoración de las tasas de muerte celular en células de glioma líneas con wtp53 (panel izquierdo) o la función de p53 deficiente (media y paneles de la derecha). Los valores representan la media de 6 repeticiones. Kim et al. La cloroquina se activa la respuesta de p53 e induce la apoptosis en células de glioma 392 neurooncología A B R I L 2 0 1 0 con cloroquina mostró desintegración de ADN genómico como se demuestra por TUNEL (Fig. 2D). Uno de los eventos tempranos inducidos por la cloroquina en células de glioma fue una disminución de la agregación mitocondrial del tinte escent fluor - JC-1 indicativa de una distorsión de la integridad potencial de la membrana mitocondrial, que precedió a la activación de la caspasa-3 y se produjo a las un tiempo mucho antes, tan pronto como 24 horas después del tratamiento (Fig. 2E). Curiosamente, un colapso del potencial de membrana mitocondrial causada por cloroquina produjo con una eficacia comparable en las células con wtp53 o mutp53 (Fig. 2E), lo que indica que la disfunción mitocondrial causada por la cloroquina puede ser un efecto independiente de p53. La cloroquina conduce a la estabilización de la proteína p53 e induce p53 transcripcional objetivos en las líneas celulares de glioma con wtp53 El aumento de la sensibilidad a la cloroquina en líneas de glioma que expresan wtp53 endógeno en comparación con las líneas celulares que expresan mutp53 (Figs 1 y 2) sugerido una participación de la vía p53 en la citotoxicidad de la cloroquina. Por lo tanto, se evaluaron los niveles de proteína p53 y sus objetivos transcripcional en líneas celulares de glioma con el estado funcional conocida de p53 mediante análisis de Western blot. Los resultados mostraron que el tratamiento con cloroquina causó una marcada estabilización de la proteína p53, whichwaschloroquine (figura 3A, shownforthe estabilización cloroquina inducida de la proteína p53 se consideró funcionalmente relevante, ya que fue acompañado por un incremento en la expresión de genes re - gulada por p53 ( la Fig. 3B, panel izquierdo). Es importante destacar que la cloroquina activatedp53 era eficaz no sólo en la inducción de genes implicados en la regulación p53 y control del ciclo celular / la reparación del ADN (MDM2 y p21), sino también de los objetivos de apoptosis de p53 (PIG3 y bax). El aumento de la cloroquina inducida en los niveles de expresión de los genes diana de p53 también se observó en otras líneas celulares que expresan wtp53 como HCT116 y G168 (Fig. 3B, panel de la derecha y los datos no mostrados). en contraste, el tratamiento con cloroquina no indujo objetivo p53 genes en las líneas de glioma que carecen fUNCIONAL p53 (Fig. 3C). Estos resultados demuestran que la línea U87MG dependiente de la dosis).La transcriptionalresponse Fig. 2. La cloroquina induce la apoptosis en células de glioma en cultivo. (A y B) la activación dependiente del tiempo de la caspasa-3 por la cloroquina en las células U87MG. Las células no tratadas o tratadas a la cloroquina se tiñeron para la forma escindida de la caspasa-3 y contrastados por DAPI. El recuadro en (A) muestra la morfología nuclear característica de las células a la cloroquina tratada. (C) Resumen de la evaluación de la activación de la caspasa-3 en células de glioma líneas con diferente estado de p53. El porcentaje de células positivas para la caspasa-3 escindido se determinó contando un mínimo de 500 células en 510 campos microscópicos en réplicas de 3 para cada condición. (D) Evaluación de la apoptosis en células U87MG por TUNEL. Se utilizó un yoduro de propidio (PI) de contraste. (E) Los efectos de la cloroquina sobre la integridad potencial de membrana mitocondrial evaluados por mediciones de la acumulación mitocondrial de fluorescente JC-1 en células de glioma con wtp53 (U87MG) o mutp53 (G112). La proporción de rojo verde JC-1 de fluorescencia / se determinó en células no tratadas o tratadas con cloroquina durante 24 o 48 horas. Kim et al. La cloroquina activa de respuesta a p53 e induce la apoptosis en células de glioma neurooncología A P R I L 2 0 1 0 393 cloroquina conduce a un aumento en el nivel de proteína p53 e induce una respuesta transcripcional dependiente de p53 en células de glioma con wtp53. Dado que la actividad de p53 está regulada en la mayoría level36,37and postraduccional como la cloroquina no influye en los niveles de transcripción p53 cripción, 38we próxima examinado la posibilidad de que clor - oquina puede inducir modificaciones posteriores a la traducción p53 conocidos por promover la estabilización de p53 en respuesta a diferentes tipos de estrés celular. En particular, estábamos interesados ​​en la evaluación de la fosforilación de p53 en un residuo de serina en la posición 15 (p53-Ser15), una modificación posterior a la traducción mediada por el kinases39 ATM / ATR y esencial para la estabilización de p53 en las células de respuesta al daño del ADN. El phosphorylationstatus evaluó en células U87MG tratados con cloroquina o por g-irradiación. Como era de esperar, g-irradiación indujo a una rápida fosforilación de p53-Ser15, que precedió a la estabilización de la proteína p53 (Fig. 3D, el panel superior, compara los niveles de p53-Ser15Pwith la p53 total de p53-Ser15 era niveles en los carriles 14) . Estos resultados indican que dañan el ADN dependiente de señalización convergen en p53 está intacta en las células U87MG. Por el contrario, la estabilización de p53 guientes tratamiento con cloroquina mugido, evidente ya 6 horas después del tratamiento (Fig. 3D, panel superior, se comparan los niveles de p53 totales en las calles 5 y 7), no fue acompañada por la fosforilación de p53 apreciable a Ser15 sobre la línea base niveles (comparar los niveles de p53-Ser15Pwith los niveles totales de p53 en los carriles 14 y 58). Se observó que esta falta de correlación entre la estabilización cloroquina inducida de p53 y su fosforilación en Ser15 no sólo en las células de glioma, sino también en el contexto diferente celular de una línea celular de carcinoma de colon HCT116, un pathway.40Similar experimental widelyused al patrón observado en células de glioma, las células HCT116 responden a la cloroquina por una estabilización marcada de la proteína p53 y la inducción de genes diana de p53 (Fig. 3D, panel derecho). En contraste con la fosforilación robusta y rápida de p53-Ser15 inducedby g-radiación (Fig. 3D paradigma Ofthe p53, bottompanel, Fig. 2. (Continuación). Kim et al. Cloroquina activa de respuesta a p53 e induce la apoptosis en células de glioma 394 NEURO - ONCOLOGY ABRIL 2 0 1 0 comparar los niveles de p53 carriles-Ser15Pin 2, 5 y 8 con los basales p53 Ser15Plevels mostrados en el carril 1), el tratamiento oquina clor - no causó un aumento considerable en la fosforilación de p53-Ser15 (comparar los niveles de p53 carriles-Ser15Pin 3, 6, y 9 con los de p53 Ser15Plevels basales que se muestran en el carril 1). Estas observaciones sugieren fuertemente que la estabilización de p53 y la activación de p53 respuesta transcripcional por la cloroquina puede depender de distintos mecanismos de señalización inducida por daño en el ADN. Higo. 3. La vía de p53 es sensible a la cloroquina. proteínas y productos de la conocida p53 objetivos p21, MDM2, bax1, o PIG3 p53 se evaluaron en líneas celulares de glioma con diferente estado de p53 (CA) y en el carcinoma de colon HCT116 línea celular humana que expresa wtp53 (B) por Western blot. Las células se trataron con diferentes concentraciones de cloroquina durante 24 horas (A) o con una dosis constante de cloroquina (30 mg / ml) durante los períodos de tiempo indicados (B y C). (D) La evaluación del estado de fosforilación de p53 en un residuo de serina en Ser15 U87MG (panel superior) y HCT116 (panel inferior) las células tratadas con cloroquina o la radiación ionizante. La forma fosforilada de p53 (p53-Ser15P) se detectó utilizando un anticuerpo 16G8 fosforilación sensible, que reconoce sólo el fosforilada p53 Ser15Pisoform. detección de p53 fue total por el anticuerpo DO-7. El componente del citoesqueleto de expresión ubicua a-tubulina o el factor de transcripción basal TBP fue evaluada para asegurar la igualdad de la carga de proteínas. Kim et al. La cloroquina se activa la respuesta de p53 e induce la apoptosis en células de glioma neurooncología A B R I L 2 0 1 0 395 inducción de apoptosis por la cloroquina Requiere p53 Los hallazgos de que la cloroquina induce la apoptosis y activa la vía de p53 planteó la cuestión de la relación causal entre ambos fenómenos. Para abordar esta cuestión, se evaluó los efectos de la caída de p53 sobre la eficacia de la apoptosis inducida por la cloroquina. líneas celulares de glioma se transfectaron con disponible comercialmente p53-siRNA para inhibir la p53 endógena. Las células transfectadas con ARNsi inespecífico (scr-siRNA) se utilizaron como control. La inhibición de la p53 por siRNA-p53 fue confirmada por la tinción de inmunofluorescencia para la proteína p53 (Fig. 4A) y por análisis de transferencia Western (datos no mostrados).Gliomacell p53-siRNA o con scr-siRNA se trataron con cloroquina durante 72 horas y se evaluaron para caspasa-3 activada. A marcar el ritmo de las células apoptóticas, el porcentaje de células positivas para escindido se determinó la caspasa-3. Los resultados mostraron que la inhibición de wtp53 por p53-siRNA condujo a una reducción significativa en el número de células positivas para la caspasa-3 activada en U87MG cloroquina tratadas y células G120 expresar wtp53 (P 0,0009 y 0,012, respectivamente, Fig. 4B ). En contraste, la inhibición de mutp53 en la línea de G112 no tuvo efecto sobre las tasas de apoptosis inducida por la cloroquina en la siRNAorscr-siRNA transfectadas con p53 (Fig. 4B). Estos resultados demuestran que wtp53 función es esencial para la inducción de apoptosis por la cloroquina. líneas de células transfectedwith cloroquina inhibe el crecimiento de glioma Experimental Nuestros resultados que la cloroquina induce la muerte de las células de glioma cultivaron nos llevó a examinar los efectos de los ratones model.41Nude chloroquinein anorthotopic se implantaron por vía intracraneal con células U87MG y asignados al azar a la cloroquina o gliomamouse placebotreatment. Ten dayspostimplantation (aproximadamente un tercio de la supervivencia media de los ratones U87MG implanta en este modelo de xenoinjerto), un grupo recibió una inyección diaria de cloroquina intratumoral en PBS y el segundo grupo se le administró PBS solo. Veinte y seis días después de la implantación, los animales fueron sacrificados y los cerebros portadores de tumores se procesaron para histología. Las mediciones histomorfométricos revelaron una reducción significativa en el tamaño medio de tumor en el grupo de cloroquina en comparación con el grupo control (P 0,0068) tumores Cloroquina tratados mostraron un número significativamente menor de células mitóticas en comparación con el grupo control (P 0,0018) (Fig 5A., panel central y la Fig. 5B), mientras que el número de células apoptóticas por TUNEL fue significativamente mayor en los tumores tratados con cloroquina en comparación con el grupo tratado con placebo (P 0,0019) (Fig. 5A, panel derecho y la Fig. 5C) . Estos datos confirman nuestros datos in vitro y demuestran que la cloroquina es eficaz en la supresión del crecimiento y la inducción de la apoptosis de glioma experimental in vivo. (Figura 5A, panel izquierdo). Discusión Este estudio demuestra los efectos de la quinolina cloroquina derivado en el crecimiento y la viabilidad de las células de glioma en cultivo y en glioma experimental en ratones desnudos. Los resultados muestran que la inducción de la apoptosis mediada por p53 es uno de los mecanismos insuficientemente acostado los efectos de crecimiento de supresión de la cloroquina. Aunque hay alguna evidencia preliminar y empírica de que la cloroquina puede retardar la progresión de glioma y mejorar el resultado en pacientes con glioblastoma, 30El base molecular de los efectos de cloroquina inducida en células de glioma siguen siendo poco caracterizada. Se demuestra que la cloroquina causa una estabilización sostenida de la proteína p53 y activa la respuesta transcripcional de p53 Fig. 4. La inhibición de p53 disminuye la respuesta apoptótica a la cloroquina en líneas celulares de glioma con wtp53. (A) Evaluación de la eficacia de la inhibición de p53 endógeno mediante transfección con siRNA inespecífico scr-o-p53 siRNA. células U251, que expresan altos niveles de mutp53 endógenas fueron transfectadas con scr-siRNA o p53-siRNA y se tiñeron con anticuerpo DO-7 para determinar el efecto de siRNAs. Kim et al. Kim et al. Ninguno declarado. Cancer Res. Kim et al. J Neurooncol. Int J Oncol. J Clin Oncol. J Cell Sci. Cancer Res. J Neurooncol. Lancet Oncol. Oncogén. J Clin Invest. J Clin Invest. Bioorg Med Chem. Surg Neurol. Res contra el cáncer. Biochem Biophys Res Commun. Clin Cancer Res. Eur J Biochem. J Clin Invest. Naturaleza. Cancer Res. Int J Cancer. Cancer Res. Kim et al. J Neurooncol. Naturaleza. J Neurosci. Kim et al.